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免疫印迹法实验原理和目的

免疫印迹(immunoblotting)又叫做蛋白质印迹(Western blotting),是通过抗原抗体的特异性结合来对复杂样品中的某种蛋白进行检测的方法。此方法是一种新的免疫生化技术。

免疫印迹法 (Western blotting) 是一种结合了免疫化学分析和技术高分辨率凝胶电泳的杂交技术。免疫印迹法是对蛋白质特性、表达与分布进行检测最常用的一种方法,例如病毒的抗体或抗原检测、多肽分子的质量测定与组织抗原的定性定量检测。免疫印迹法具有很强的特异性,很高的敏感度以及很大的分析容量。免疫印迹法(immunoblotting test,IBT)也叫做酶联免疫电转移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITB),由于其类似于Southern早先建立的检测核酸的印迹方法 Southern blot ,因此也被叫做Western-blot。


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电转移方法

一般需要利用电泳方法将经电泳分离后的蛋白转移到固相载体上,这个过程被叫做电泳印迹。以下为常用的两种电转移方法。

1.半干法:

用缓冲溶液浸湿的滤纸将凝胶和固相载体夹在中间,通电10-30min。


2.湿法:

在转移缓冲溶液中浸放凝胶和固相载体夹心,由45min延长到过夜为转移时间。

因为湿法有更大的使用弹性而且没有对更多的时间和原料产生明显地浪费,所以这里仅对湿法的基本操作过程进行描述。

需要采用可以识别一抗的第二抗体来识别目的蛋白,往往将购买的成品,即是如辣根过氧化物酶般已经被结合或标记了特定的试剂作为抗体。利用辣根过氧化物酶所催化的一个比色反应,即是这种标记,该反应的产物在固相载体上固定以及有特定的颜色,鉴别非常容易。所以能够根据识别二抗来对一抗进行识别,从而使目标蛋白所在的位置被判断出来。碱性磷酸酶系统和125I标记系统均属于其他的识别系统。


实验原理

蛋白质印迹法又叫做免疫印迹法,这是一种能够对固定在固相载体上蛋白质进行检测的免疫化学技术方法。待测蛋白除了可以为粗提物,而且还能够经过一定的分离和纯化。应用该项技术,待测蛋白的单克隆或多克隆抗体需要被利用来进行识别。可溶性抗原也就是待测蛋白的分离首先需要按照如分子量,分子大小,电荷以及其等电点等性质的差异采用不同的电泳方法。凝胶中的蛋白质通过电流被转移到聚偏二氟乙烯膜上。目的蛋白的钓取可以以抗体作为探针利用抗体(一抗)与抗原发生特异性结合的原理来进行。尤其留心的是在将一抗加入之前,首先需要将非特异性蛋白加入,例如膜被牛血清白蛋白“封阻”,而使膜的非特异性结合得以避免。


实验目的

对蛋白质印迹法的基本原理及其操作和应用进行了解。


2019-08-23 17:30:00 浏览次数:283次
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