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免疫印迹法操作步骤

免疫印迹法就是将蛋白质往膜上转移,之后利用抗体进行检测。能够使用相应抗体作为一抗对已知表达蛋白进行检测,能够通过融合部分的抗体对新基因的表达产物进行检测。


操作步骤

一、获取蛋白质样品:

细菌诱导表达后,能够通过电泳上样缓冲液将细胞直接裂解,将匀浆缓冲液加在真核细胞上,机械或超声波室温匀浆0.5-1分钟。之后4摄氏度下13,000g离心15分钟,取上清液作为样品。


二、电泳:

对电泳凝胶进行制备,进行SDS-PAGE。


4.jpg


三转移:(半干式转移)

1、完成电泳后将胶条切成合适大小,使用转膜缓冲液平衡,分别进行3次,每次5分钟。

2、膜处理:将与胶条同样大小的滤纸和NC膜预先裁好,将其在转膜缓冲液中浸没10分钟。

3、转膜:转膜装置按照从下至上的顺序依次将阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板放好,精确对齐滤纸、凝胶、NC膜,每一步均将气泡去除,将500g重物压上,吸干碳板上多余的液体。将电源接通,恒流1mA/cm2,转移1.5hr。完成转移后,将电源断开,取出膜,对待测膜条割取来做免疫印迹。在膜染色液中放入有蛋白标准的条带染色50秒之后,在50%甲醇中多次脱色,至背景清晰,然后用双蒸水洗,风干,保存在两层滤纸之间,和显色结果对比。


四免疫反应:

1、洗膜使用0.01M PBS进行清洗,每次5分钟,一共3次。

2.将包被液加入加入,室温下保持2小时。

3.将包被液弃掉,洗膜使用0.01M PBS进行清洗,每次5分钟,一共3次。

4.将一抗加入(用0.01M PBS根据合适稀释比例进行稀释,膜必须全部为液体所覆盖),在4摄氏度下放置超过12小时,阴性对照,一抗使用1%BSA替代,其余步骤和实验组一样。

5.将1%BSA和一抗弃掉。膜使用0.01M PBS分别进行清洗,每次5分钟,一共4次。

6、将辣根过氧化物酶偶联的二抗加入(用0.01M PBS根据合适稀释比例进行稀释),平稳摇动,室温下保持两个小时。

7、将二抗弃掉,膜使用0.01M PBS进行清洗,每次5分钟,一共4次。

8、将显色液加入,避光显色直到有条带出现放入双蒸水中使得反应终止。


2019-08-23 17:26:15 浏览次数:141次
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