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免疫印迹法原理、试剂准备和注意事项

免疫印迹法就是将蛋白质往膜上转移,之后利用抗体进行检测。能够使用相应抗体作为一抗对已知表达蛋白进行检测,能够通过融合部分的抗体对新基因的表达产物进行检测。


原理

Western Blot类似于Southern或Northern杂交方法,然而其采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,用标记的二抗来“显色”,抗体为“探针”,蛋白质为被检测物。经过PAGE分离的蛋白质样品往固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上转移,固相载体以非共价键形式来进行蛋白质的吸附,并且可以使其生物学活性和电泳分离的多肽类型保持不变。抗原使用固相载体上的蛋白质或多,和对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过放射自显影或者底物显色来对电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分进行检测。该技术也在蛋白水平的表达的检测方面得到广泛地应用。


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试剂准备

1、0.01M PBS(pH7.4):

Na2HPO4 1.44g;

KH2PO4 0.24g;

NaCl 8.0g;

KCl 0.2g;

加ddH2O至1000ml。


2、膜染色液:

乙酸2ml;

ddH2O118 ml;

包被液(5%脱脂奶粉,现配):脱脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。

考马斯亮兰 0.2g;

甲醇80ml。


3、显色液:

硫酸镍胺 0.1ml;

H202 1.0μl;

DAB 6.0mg;

0.01M PBS 10.0ml。


4、SDS-PAGE试剂:见电泳实验。


5、匀浆缓冲液:

10%SDS 6.0ml;

1.0M Tris-HCl(pH 6.8);

1.OmlddH2O 2.8ml;

β-巯基乙醇 0.2ml。


6、转膜缓冲液:

SDS 0.37g;

甲醇200ml;

甘氨酸 2.9g;

Tris 5.8g;

加ddH2O定容至1000ml。


注意事项

1、DAB有潜在可能致癌,要小心仔细地操作。


2、使用时必须新鲜配置显色液,最后将H2O2加入。


3、不同的蛋白要经过预实验来确定一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度的最佳条件。


2019-08-23 17:22:58 浏览次数:146次

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